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邁向更輕鬆的基因組編輯

Skoltech的研究人員及其來自俄羅斯和美國的同事描述了兩種新的緊湊型Cas9核酸酶,它們是CRISPR-Cas系統的切割組分,將有可能擴展Cas9工具箱進行基因組編輯。已顯示兩種核酸酶之一在人細胞中起作用,因此可以具有生物醫學應用。該論文發表在雜誌上 核酸研究.

CRISPR-Cas是從細菌中藉來的基因組編輯技術,它依賴於Cas核酸酶。這些酶在CRISPR RNA的指導下可以降解靶基因序列-它們是諾貝爾獎得主“遺傳剪刀”的刀片。在研究應用中,最受歡迎的Cas9核酸酶是一種化膿性鏈球菌,即II-A型SpCas9。它既有效又相對簡單,因為一種大蛋白既可以與crRNA結合又可以切割DNA。它還需要一個簡短的PAM,即一串核苷酸,將酶用來定位和“讀取”目標位點的核苷酸固定在位。

但是SpCas9是一種大蛋白,當人們想使用腺相關病毒(AAV)顆粒作為將“遺傳剪刀”傳遞到細胞中的載體時,就會產生問題。理想情況下,既要適合編碼Cas蛋白的基因,又要適合911娛樂城 將RNA引導到單個顆粒中,並且該大小限制要求使用較短的Cas9品種。但是,那些較短的核酸酶往往需要更長,更複雜的PAM,因此研究人員面臨著蛋白質大小與靶標選擇之間的權衡。

在最近為她的Skoltech博士辯護的Iana Fedorova和Skoltech Severinov實驗室的研究科學家Aleksandra Vasileva及其同事的新論文中,描述了兩種新的小Cas9核酸酶,它們衍生自生活在熱液噴口中的Defluviimonas sp.20V17和巴斯德氏菌。塵肺,一種在囓齒動物和其他哺乳動物中發現的常見細菌。這些核酸酶恰好足夠用於AAV載體,並具有相對較短的PAM,這是Cas9酶的“兩全其美”選擇。

新的核酸酶與II-C型CRISPR-Cas系統有關,與SpCas9相比,通常以較小的Cas9效應子為代表。這些蛋白質採用類似於其他Cas9蛋白質的保守雙葉結構,但也具有獨特的功能:它們缺少幾個插入子結構域,並且具有較小的楔形結構域(負責與單嚮導RNA支架相互作用的結構域),因此更加緊湊

“實際上,II-C型效應子往往需要更長的PAM序列,但這只是基於迄今為止表徵的有限數量的II-C型效應子的觀察結果。例如,最近發現的來自金黃色葡萄球菌的SauriCas9與PpCas9類似,需要一個簡短的PAM(5′-NN娛樂城賺錢GG-3’)。很快就會發現需要短PAM的更多II-C型Cas9酶。這些具有不同PAM要求的小Cas9蛋白擴大了真核和原核基因組中可能可編輯的DNA靶標的數量,” Fedorova說。

在細菌中進行的體外研究和實驗表明,這兩種核酸酶可有效切割DNA,而嗜肺假單胞菌Cas9核酸酶在人細胞中具有活性。事實證明,它與其他已在真核細胞Nme1Cas9和Nme2Cas9中起作用的Cas9核酸酶非常相似。儘管需要更多的研究來確定這些核酸酶的效率,但作者認為它們可能為微生物工程和生物醫學基因組編輯中使用的更常規的核酸酶提供可行的替代方法。

Iana Fedorova指出,對PpCas9脫靶(意料之外的修飾)的初步研究表明,該酶具有合理的特異性。但是為了證明PpCas9足夠具體 王者娛樂城要被視為基因組編輯工具,需要使用更複雜的方法進行其他研究。

“而且,看起來PpCas9演示了selectiv真人娛樂城對細胞中不同基因的靶向性。它可能會減少可能的PpCas9基因組靶標的範圍,這種偏倚的性質是有待進一步研究的課題。”

參考:Fedorova I,Vasileva A,Selkova P等。嗜肺巴斯德氏菌的PpCas9-在人細胞中活躍的緊湊型II-C Cas9直系同源物。 核酸研究2020; 48(21):12297-12309。 doi:10.1093 / nar / gkaa998。

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